Soutenance de thèse de Mohamad YEHYA

La ventilation mécanique en réanimation (VM) est une mesure de sauvetage pour les patients qui présentent une incapacité temporaire à assurer par leur fonction ventilatoire une oxygénation tissulaire adéquate. Elle peut pourtant être à l’origine d’une dysfonction diaphragmatique induite par la ventilation (DDIV), augmentant la dépendance du patient à son ventilateur et la durée de son séjour en réanimation. La mise au repos brutale du diaphragme induite par la ventilation peut engendrer un stress énergétique ainsi qu’un stress mécanique participant à l’initiation d’un stress oxydant à la base d’une DDIV. Ainsi, l’objectif de cette thèse est d’évaluer les mécanismes physiopathologiques impliqués précocemment dans la genèse de ce stress oxydant et d’en faire le lien mécanistique avec la dysfonction contractile du diaphragme ventilé sur un modèle murin. La compréhension de ces mécanismes nous permettra de proposer des nouvelles pistes thérapeutiques afin de limiter l’impact négatif de cette pathologie sur le devenir des patients pris en charge en réanimation par la ventilation mécanique. Dans notre première étude, nous avons montré pour la première fois, dans le diaphragme de souris ventilées mécaniquement, la présence dès 6 heures de ventilation d’un stress oxydant mitochondrial responsable d’un remodelage biochimique précoce du canal de libération du calcium du réticulum sarcoplasmique RyR1, aboutissant à des troubles de l’homéostasie calcique à la base d’altération du couplage excitation-contraction (CEC), impliqués dans la DDIV. Nous avons également montré qu’avec une période plus longue de VM, cette altération de l'homéostasie calcique contribue à une activation secondaire du système de protéase calcium-dépendant liée au désassemblage des complexes d'actomyosine et à l'atrophie participant à la DDIV. Enfin nous avons montré qu’en ciblant pharmacologiquement le RyR1 afin de réduire les fuites calciques nous pouvions prévenir la DDIV. La mise au repos du diaphragme engendre précocemment un phénomène de fission mitochondriale qui a été lié à un stress métabolique. Dans notre deuxième étude, nous montrons que cette fission mitochondriale précoce est responsable d’un stress oxydant mitochondrial et que son inhibition pharmacologique au cours de la VM prévient la production de ROS d’origine mitochondriale ainsi que le remodelage du canal calcique RyR1 avec une bonne efficacité thérapeutique sur la prévention de la DDIV. La ventilation mécanique, par la genèse d’assynchronie entre le patient et son ventilateur peut induire un stress mécanique dont l’implication dans le DDIV est mal connue. Sur un modèle murin dystrophique (souris mdx), dont le diaphragme est plus sensible au stress mécanique du fait d’une déficience en Dystrophine, nous avons modélisé ce stress au cours de la ventilation mécanique par l’application in vitro, après 6 heures de ventilation, de contractions excentriques. Ainsi, dans notre troisième étude, nous avons monté que 6 heures de VM chez la souris mdx augmentent la susceptibilité du diaphragme aux contractions excentriques impliquant un remodelage biochimique des canaux RyR1 et une présence de fuite de Ca2+ intracellulaire. Nous démontrons sur ce modèle murin dystrophique, qu’un stress mécanique appliqué in vitro après 6 heures de VM, pouvait activer les NOX2, à la base d’un stress oxydant venant aggraver le remodelage du diaphragme RyR1 déjà altéré par la VM. Nous avons également montré que l’inhibition pharmacologique de NOX2 gommait les effets délétères de ce stress mécanique imposé in vitro. Enfin, nous montrons également dans ce dernier travail, qu’un entraînement respiratoire préventif des muscles respiratoires chez la souris mdx atténue la DDIV ainsi que la susceptibilité à la contraction excentrique induite par VM. Ce travail préliminaire devra être continué afin d’évaluer les mécanismes de cette amélioration induite par cet entrainement.

Mechanical ventilation in the intensive care unit (MV) is a rescue measure for patients who have a temporary disability to provide adequate tissue oxygenation through their ventilatory function. It may, however, be the cause of a ventilator-induced diaphragmatic dysfunction (VIDD), increasing the patient's dependence on his ventilator and his length of stay in intensive care unit. Sudden resting of the diaphragm induced by ventilation can cause energy stress as well as mechanical stress participating in the initiation of oxidative stress at the base of an VIDD. Thus, the aim of this thesis is to evaluate the physiopathological mechanisms involved in the genesis of this oxidative stress and to make the mechanistic link with the contractile dysfunction of the diaphragm ventilated on a murine model. The understanding of these mechanisms will allow us to propose new therapeutic approaches to limit the negative impact of this pathology on the future of patients treated in intensive care by mechanical ventilation. In our first study, we showed for the first time, in the diaphragm of mechanically ventilated mice, the presence of a mitochondrial oxidative stress at 6 hours of ventilation, responsible for an early biochemical remodeling of the calcium release channel of the sarcoplasmic reticulum RyR1, leading to disorders of calcium homeostasis at the base of alteration of excitation-contraction coupling, involved in the VIDD. We have also shown that with a longer period of MV, this alteration of calcium homeostasis contributes to a secondary activation of the calcium-dependent protease system linked to the disassembly of actomyosin complexes and to atrophy participating in the VIDD. Finally, we have shown that by pharmacologically targeting RyR1, in order to reduce calcium leak, we could prevent VIDD. Resting the diaphragm early results in a mitochondrial fission phenomenon that has been linked to metabolic stress. In our second study, we show that this early mitochondrial fission is responsible for mitochondrial oxidative stress and that its pharmacological inhibition during MV prevents the production of ROS of mitochondrial origin as well as the remodeling of the RyR1 calcium channel with good therapeutic efficacy on the prevention of VIDD. Mechanical ventilation, by the genesis of assynchrony between the patient and his ventilator can induce a mechanical stress whose involvement in the VIDD is poorly known. In a dystrophic murine model (mdx mice), whose diaphragm is more sensitive to mechanical stress due to a deficiency in dystrophin, we modeled this stress during mechanical ventilation by in vitro application, after 6 hours of ventilation, eccentric contractions. Thus, in our third study, we found that 6 hours of MV in mdx mice increase the susceptibility of the diaphragm to eccentric contractions involving biochemical remodeling of RyR1 channels and the presence of intracellular Ca2 + leakage. We demonstrate on this dystrophic murine model, that a mechanical stress applied in vitro after 6 hours of MV, could activate the NOX2, at the base of an oxidative stress coming to aggravate the remodeling of the diaphragm RyR1 already altered by the MV. We have also shown the pharmacological inhibition of NOX2 to erase the deleterious effects of this mechanical stress imposed in vitro. Finally, we also show in this last work, that a respiratory breathing preventive training in the mdx mice attenuates the VIDD as well as the susceptibility to the eccentric contraction induced by MV. This preliminary work should be continued in order to evaluate the mechanisms of this improvement induced by this training. Thus during this thesis we were able to identify the mechanisms involved in